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免疫系統和膽結石

時間:2021-06-16 來源: 瀏覽量:726

從一粒沙子的大小到高爾夫球的大小,膽結石對于患有膽結石的人來說可能非常痛苦,并且在某些情況下還會引起惡心和嘔吐。膽結石是全世界人們前往醫院的主要原因。

免疫細胞是導致膽結石形成的原因

最近的證據表明,免疫細胞是導致膽結石形成的原因。

2019 年 9 月,德國的一組研究人員在《免疫》雜志上發表了他們的研究結果,描述了粘性網狀結構 DNA 和蛋白質(稱為中性粒細胞)如何將鈣與膽固醇晶體結合在一起,從而導致膽結石的形成。

免疫細胞是導致膽結石形成的原因

實驗模型和細節

人體組織樣本

在常規臨床實踐中用于選擇性支架更換程序的內窺鏡逆行胰膽管造影術 (ERCP) 中回收了肝膽支架,并在 -20°C 下冷凍保存用于后續分析。膽結石取自柏林 Charité 的收藏品,以及在德國哈斯福特哈斯伯格診所普外科的選擇性膽道手術后立即從患有非復雜性膽囊結石的成年患者身上獲得。

 豬膽液

在官方獸醫人員的監督下,從當地屠宰場處死供人類食用的六頭健康豬中取出六個膽囊。在運送到實驗室的第一個小時內,將夾住的膽囊放在獨立容器中的冰上。膽汁液和污泥通過針頭(18 號)抽吸收集并立即分析。

 中性粒細胞浸潤的氣囊模型

在氣囊模型中評估了體內aggNETs 的形成。對于這 20 只小鼠,用異氟醚麻醉,并在背部皮下注射 3 mL 無菌空氣以形成氣囊。第一次注射后三天,我們將另外 2 mL 的無菌空氣注入先前存在的小袋中。又過了 2 天,將 PBS 中的 1 mg 膽固醇晶體注射到氣囊中。小鼠用單劑量的Cl -脒(n = 5, 0.5 mg)、DPI(n = 5, 100μg)或秋水仙堿(n = 5, 100μg)預處理(ip )。24 小時后,對小鼠實施安樂死,并評估氣囊內容物是否存在 aggNETs

 膽石癥小鼠模型

為了誘導膽結石的形成,將 20-35 g 的小鼠在含有 0.5% 膽酸、1% 膽固醇和 10% 脂肪的碎石顆粒飲食中飼養 5 到 9 周,并且可以自由飲水. 由于菌株的可用性,在三種不同的動物設施中進行了實驗。

對于預防性治療實驗,C57BL/6N 雄性小鼠被喂食補充有 0.0094% w/w 美托洛爾(N = 7)或載體(NaCl;N = 13)的生石飲食或每天接受 4 mg/kg PADI4 特異性在利沃夫國立醫科大學的動物設施中,在石化飲食暴露 5 周期間使用抑制劑 GSK484(N = 8)或載體(NaCl;N = 6)。為了治療現有的膽結石,28 只 C57BL/6N 雄性小鼠在沒有治療的情況下被喂食生石飲食 5 周。在第 5 周處死 13 只小鼠進行基線分析,另一只繼續進行石化飲食另外 3 周,接受上述濃度的載體(NaCl;N = 5)、美托洛爾(N = 5)或 PADI4 抑制劑 GSK484(N = 5) .

在所有小鼠中,取出、打開膽囊并分析結石的存在和大小。對 (i) 結石和結石 (> 500 μm) 的流行率進行了分析,(ii) 每只小鼠的結石累積大小和 (iii) 每組單個結石的直徑。

 方法詳情

 膽結石的顯微計算機斷層掃描

使用掃描儀對膽結石進行 μCT 掃描。使用 70 kV 能量設置以 6.3μm 的體素尺寸進行掃描。膽結石被定位并固定。所有掃描均包含 200 多個切片。SCANCO 軟件用于圖像的三維可視化。μCT圖片用Photoshop CS5進行定量處理和分析。

 中性粒細胞的分離

通過 Lymphoflot  密度梯度離心從正常健康供體 (NHD) 的肝素化 (20 U ml-1) 靜脈血中分離人外周血中性粒細胞。簡而言之,將全血小心地移到 Lymphoflot 溶液中,并以 1400 rpm 的速度離心 30 分鐘。然后小心地取出血漿并丟棄單核細胞。取出紅細胞 (RBC) 頂部的富含嗜中性粒細胞的層,并對其進行低滲裂解。從 C57BL/6 和 PADI4 缺陷小鼠的非貼壁骨髓細胞的單細胞懸浮液中獲得鼠中性粒細胞。通過臺盼藍排除法評估細胞活力。細胞懸液的純度通過流式細胞術測定(人 > 95%;鼠 > 80%)。

 膽固醇晶體激活中性粒細胞

通過在 10 μg/ml Lucifer Yellow(默克,達姆施塔特,德國)存在下,將 200 μg/ml 膽固醇晶體與中性粒細胞共孵育來評估粒子內化,這是一種膜不可滲透的熒光染料,當細胞吞噬微粒靶標時會被共同攝入。通過流式細胞術(Beckman-Coulter,Miami,USA)量化共孵育 30 分鐘后活細胞中熒光的增加。通過將可滲透細胞的 ROS 傳感器二氫羅丹明 123(0.5μM;Thermo Fisher Scientific,D23806)加載中性粒細胞并通過流式細胞術進行后續分析,評估暴露于膽固醇晶體(30 分鐘)的粒細胞產生的 ROS。pH 敏感熒光探針 Lysosensor? Green DND-189(Thermo Fisher Scientific,L7535)用于在生命細胞熒光顯微鏡中跟蹤溶酶體的完整性。通過添加 1μg/ml 的肌動蛋白解聚劑細胞松弛素 D來阻斷膽固醇晶體的內化。一些暴露于膽固醇的中性粒細胞用 -20°C 乙醇固定兩分鐘,用抗組織蛋白酶 G 抗體進行免疫染色。使用細胞不可滲透熒光染料 Sytox Green (2.5μM) 在 Infinite? 200 PRO 讀板機上于 37°C、5% CO監測暴露于 200μg/ml 膽固醇晶體的中性粒細胞的 DNA 外化2激發波長為 485nm,發射波長為 535nm。

 膽結石的治療

儲存的人膽結石用 3% (v/v) H 2 O 2和 H 2 O清洗10 分鐘。將結石浸入碘化丙啶 (10μg/ml) 浴中進行 DNA 染色和斜照明攝影。膽結石作為一個整體研磨或通過層層撇去獲得材料。用陶瓷刀沿著中心切割石頭,研磨表面、主體和中心的材料,并保持在室溫下進行進一步分析。為了去除脂質,我們用 100% 異丙醇處理手術后新鮮分離的人類 GS 3 次,持續 30 分鐘,最后在環境溫度下過夜。

 粒子聚集測定

為了分析來自 GS 礫石或膽固醇晶體或碳酸鈣 (CaCO 3 ) 晶體的晶體在體外形成的聚集體,我們在含有 48 mM 碳酸氫鹽的培養基中,在含有 5 % CO 2并通過 100μM 網篩過。在圖 2 A 頂部顯示的實驗中,我們旋轉了安裝在軸向支架上的膽結石。使用滾動裝置(圖2D 和 2E)或軌道振蕩器(圖2A底部,圖2B 和 2C;圖 S2)進行其他測定。

 熒光顯微鏡和宏觀

顯微鏡進行熒光顯微鏡檢查。執行 Z 堆棧以增加景深。

共聚焦成像

對于膽石礫石、膽固醇晶體和碳酸鈣的高倍放大成像,使用帶有 AOTF 和 AOBS 的 Leica SP5 II 共聚焦顯微鏡,并使用 DMI6000 CS 框架上的 HyD 檢測。蓋玻片嵌入樣品的成像是通過 NA 為 1.44 的 HCX PL APO 100x 油物鏡進行的。熒光信號是通過順序掃描產生的,使用 561nm 的 DPSS 激光激發碘化丙啶,并使用 600-650nm 的 HyD 檢測。用于可視化樣品自發熒光的第二個序列包括用于激發的 488nm 氬激光器和 500-550nm 的 HyD 檢測器。中性粒細胞標志物的免疫染色

將膽結石碎片粉碎在載玻片上并用 4% 多聚甲醛固定 10 分鐘,然后在 4°C 下在含有 10% FBS的 PBS 中封閉 18 小時。

人膽結石中的中性粒細胞彈性蛋白酶活性

將膽石研磨材料重新懸浮在 500 μl PBS中。將 25 μl 這種材料加入 175 μl PBS + 25 μl 1M 熒光底物 MeOSuc-AAPV-AMC和黑色 96 孔板中的H 2 O 載體對照. 當指出時,膽結石制劑用 25 μg/ml DNase 1 處理以促進酶從 NET 中釋放。使用過濾器組(激發 360,發射 465)在 TECAN Infinite 200 Pro 上以 10 分鐘的間隔收集 37°C 下的熒光讀數 10 小時。用技術一式三份進行測定。

 分子膽液成分的定量

使用 Respons910 分析儀在全膽汁中酶促地測量總膽汁鹽濃度。

量化和統計分析

兩側Student's t檢驗或Mann-Whitney U檢驗分別用于數據正態分布與否的兩個獨立組之間的比較。


論文鏈接:https://www.cell.com/immunity/fulltext/S1074-7613(19)30318-8

 

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