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中國科大在活細胞深低溫冷凍保存方向取得重要進展

時間:2021-02-12 來源: 瀏覽量:641

       低溫保存是通過使用非常低的溫度(-80或-196°C)來長期保存器官,組織,細胞和其他生物材料的基本且重要的技術。在冷凍保存溫度條件,在活細胞中的化學反應和生物反應顯著減少,甚至停止,這是用于實現各種生物樣品的長期保存的基本機制。

       冷凍保存的細胞或組織不僅維持從低溫解凍后正常結構和功能完整性,也允許進一步的臨床應用和基礎研究。到目前為止,基礎理論,低溫設備,冷凍保存策略以及用于冷凍保存的新型冷凍保護劑(CPA)在冷凍生物學領域取得了突破,從而促進了冷凍保存的許多生物醫學應用的廣泛發展,包括輔助生殖,干細胞療法,再生醫學,組織工程,生物樣本庫以及藥物的開發和研究。例如,基于干細胞醫學的最新進展,對干細胞的需求急劇增加。因此,實現干細胞的高質量和高效存儲對于克服當前的供需不平衡至關重要。此外,另一種典型的應用領域是人的生育。最近,由于偶爾的疾病,積極的藥物使用和外部壓力,年輕女性的不孕風險已經增加。全世界年輕人中發生的生殖疾病嚴重影響了他們的生育能力。因此,卵細胞,精子,卵子和胚胎的冷凍保存對于人類繁殖至關重要??傊?,對于各種生物樣品(例如,細胞,組織,器官和疫苗)而言,首要且必不可少的冷凍保存科學對于生物醫學工程領域的臨床應用和科學研究至關重要。

       冷凍保存期間的冰損傷

       作為保存生物標本的基本和重要方法,冷凍保存可以有效地減少新陳代謝,并為各種生物學應用提供重要支持。圖 A總結了在冷卻和加熱過程中發生的基本低溫保存程序和低溫傷害。值得注意的是,在冷凍保存的融化過程中,冰晶的形成和生長是導致細胞活力喪失的主要問題。冰晶在整個低溫保存過程中是不可避免的,其控制和抑制對于最大限度地減少細胞損傷至關重要。

       通常,在凍融循環過程中,冰損傷可分為細胞外和細胞內冰。它公知的是低溫細胞的存活在很大程度上取決于冷卻速率,,其可以被定義為緩慢冷凍和玻璃化(圖 B)。如圖C所示 ,根據拖曳因子假設理論,關于緩慢冷凍,大多數細胞內水流出是因為細胞內水的化學勢高于細胞外冰相的化學勢,這導致細胞脫水,并因此引起細胞外冰和滲透壓損害。隨著冷卻速率的增加,細胞內的水不能迅速流出,從而形成細胞內的冰并在冷凍過程中導致對細胞的致命性冷凍傷。無論緩慢或快速冷凍,冰晶的形成都是不可避免的,在冷卻過程中優化細胞外和細胞內的冰晶并最大程度地減少對細胞的冰害至關重要。尤其,玻璃化冷凍保存可以避免冷凍過程中的冰損傷,這是由于在高濃度的CPA的幫助下溶液的無冰狀態。然而,在解凍階段發生的失透和重結晶可能對冷凍保存的細胞造成致命的損害。此外,高濃度CPA的毒性也是玻璃化冷凍保存策略的主要問題和局限??傊?,冰成核的形成,冰晶的生長以及冰的再結晶/失透是限制冷凍保存效率和質量的三個主要因素(圖 高濃度CPA的毒性也是玻璃化冷凍保存策略的主要問題和局限性??傊?,冰成核的形成,冰晶的生長以及冰的再結晶/失透是限制冷凍保存效率和質量的三個主要因素(圖 高濃度CPA的毒性也是玻璃化冷凍保存策略的主要問題和局限性??傊?,冰成核的形成,冰晶的生長以及冰的再結晶/失透是限制冷凍保存效率和質量的三個主要因素(圖 D)。

冷凍保存期間的基本冰損傷

       近日,中國科學技術大學電子科學與技術系趙剛課題組和馬里蘭大學何曉明課題組合作,利用低濃度的海藻糖這一單一的低溫保護劑實現了細胞的高效低溫保存。

       傳統的細胞低溫冷凍保存方法通常需要使用滲透性的、有毒的有機溶劑(例如二甲基亞砜、甘油等)作為低溫保護劑,復溫后的細胞必須經過繁瑣的洗滌過程去除細胞內外的有機溶劑才能實際應用。而海藻糖是一種天然的二糖,廣泛存在自然界多種微生物中,相對于傳統的低溫保護劑而言,具有無毒高效的低溫保護效果。已有研究表明,海藻糖必須同時存在于細胞膜內外兩側時,其保護效果才最佳。然而,哺乳動物細胞自身不能合成海藻糖,且其細胞膜上沒有海藻糖轉運蛋白,這就導致海藻糖無法高效、無損地進入細胞內部,嚴重限制了海藻糖在細胞低溫冷凍保存中的應用。


冷響應納米膠囊封裝的海藻糖用于細胞低溫保存

       面對這一挑戰,中國科學技術大學趙剛課題組和馬里蘭大學何曉明課題組合作,創造性地設計了一種冷響應的納米膠囊,用于海藻糖的納米尺度封裝、細胞內遞送和溫度控制釋放。且使用該方法成功實現了兩種典型細胞的低溫冷凍保存,其保存效果與傳統的二甲基亞砜相當,卻完全避免了伴隨傳統低溫保護劑的復溫后的繁瑣的、損傷性的細胞洗滌過程。

研究人員基于水熱法成功將聚乙烯吡咯烷酮與二硒化鎢復合,通過調控合成參數,制備出納米片和納米花形態的納米復合材料?;诠δ懿牧吓c外部物理場的協同作用,這種納米復合材料集成了抑制冰晶的形成、生長以及快速消融的一體化功能,因此可以顯著降低細胞低溫保存過程的冰晶損傷,極大的提高細胞保存效率。

基于氫鍵、吸附抑制以及光熱轉換效應實現冰晶的協同抑制以提升活細胞深低溫冷凍保存效果

       基于該納米復合材料的協同冰晶抑制效應,研究結果表明:1)降溫過程中納米材料具有可以調控冰晶成核的作用,顯著降低溶液過冷度,從而可以顯著降低樣品在降溫過程遭受的冰晶損傷。2)基于吸附-抑制效應,發現該種納米復合材料可以選擇性的吸附至冰晶界面處,從而抑制復溫過程中的冰晶再結晶;同時基于納米材料的光熱轉換效應,可以實現冰晶的快速消融,促使生物樣品快速穿過危險溫區,降低復溫過程遭受的低溫損傷。3)基于冰晶協同抑制效應,實現了活細胞構建物在低濃度保護劑(2 M)下的快速冷凍保存,具有與商用二甲基亞砜(10%)同等的保存效果,并且保存樣品可以在體內連續存活多天并且保持正常的增長增殖,表明該種保存方式的可靠性與穩定性,有望為后續的細胞治療提供了全新的保存方式。

 

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